目前對此類病毒的診斷有多種方法。我國已經(jīng)應(yīng)用單克隆抗體介導(dǎo)的固相微球直接ELISA，可檢出5.63和2.85mg/mL的抗體蛋白。在美國曾用壁赤酵母表達(dá)系統(tǒng)高效表達(dá)偽狂犬病毒糖蛋白gE(可達(dá)106.7mg/mL)后將其作為包被抗原建立了間接ELISA方法，經(jīng)交叉試驗(yàn)證實(shí)特異性良好。用HＲPO標(biāo)記純化的兔抗豬IgG，制備出高效價的酶標(biāo)抗體，經(jīng)各種條件的篩選，建立了檢測豬偽狂犬血清抗體的間接ELISA，陽性檢出符合率均為100%。將PＲVgD基因插入桿狀病毒載體中進(jìn)行表達(dá)，制備重組抗原，建立了競爭ELISA，特異性100%，敏感性為96%～98%。根據(jù)疫苗株所缺失的糖蛋白構(gòu)建的gE－ELISA、gC－ELISA、gG－EliSA可用來區(qū)分疫苗接種豬和野毒感染豬，以gE－ELISA靈敏度最高。利用大腸桿菌表達(dá)gE基因N末端氨基酸1～125位的融合蛋白為基礎(chǔ)而建立的重組gE－ELISA;利用親和層析技術(shù)從病毒粒子中提純的天然gE蛋白為基礎(chǔ)而建立的親和層析gE－ELISA，這2種間接ELISA的敏感性和特異性均能區(qū)分gE基因缺失疫苗免疫的動物與野毒感染動物。目前我國也建立了可以測定gE抗體的野毒鑒別診斷方法，并得到了廣泛的應(yīng)用。

     為了解目前我國規(guī)?；i場偽狂犬病野毒感染狀況與特點(diǎn)，本試驗(yàn)應(yīng)用PＲVgE－ELISA對送檢血樣進(jìn)行檢測，分析種公豬群與種母豬群帶毒率的相關(guān)性以及種豬群與商品豬群野毒感染的相關(guān)性，為在不同情況下制訂偽狂犬病控制凈化措施提供依據(jù)。

     種豬群待檢血清672份，采自國內(nèi)24個大型規(guī)?；N豬場。每組根據(jù)豬場規(guī)模大小取5～10頭種豬作為采樣基數(shù)。有條件的可以把公豬群全部采血。采樣時，耳靜脈或前腔靜脈采血5mL，按常規(guī)方法分離血清。

     河南省幾個大型規(guī)?；N豬場采集待檢血清1062份。第1組按照種公豬有偽狂犬病野毒感染，仔豬群進(jìn)行了滴鼻免疫的條件選擇了17個場870份樣品;第2組按照種公豬沒有偽狂犬病野毒感染，仔豬群也沒有滴鼻免疫的條件選擇了5個場192份樣品。采樣時，每組根據(jù)豬場規(guī)模大小取5～10頭豬作為采樣基數(shù)。

     PＲVgE抗體檢測試劑盒來自北京愛德士元亨生物科技有限公司生產(chǎn)。酶標(biāo)檢測儀、微量移液器等由河南農(nóng)業(yè)大學(xué)畜禽疫病防治研究室提供。

     應(yīng)用PＲVgE抗體檢測試劑盒檢測送檢血清，從而判定其是否為偽狂犬病野毒感染。操作方法嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行。(1)用樣品稀釋液將被測樣品作2倍稀釋;(2)取樣品后更換滴頭，準(zhǔn)確記錄每個樣品在板上的位置，每個樣品滴加到偽狂犬包被板前應(yīng)充分混勻;(3)取出抗原包被板，在記錄表上記錄樣品位置;(4)在Al、A2、A3，孔內(nèi)加入100μL兩倍稀釋的陰性對照;(5)在A4、A5空內(nèi)加入100μL兩倍稀釋的陽性對照;(6)其余孔內(nèi)分別加入100μL已稀釋好的被檢樣品;(7)室溫下孵育1h或2～7℃過夜;(8)用大約300μL洗滌液洗滌板孔，重復(fù)3～5次每次洗滌時洗滌液都應(yīng)吸出棄去。在洗滌和加入標(biāo)識物之間應(yīng)避免包被板變干，在最后一次洗滌液吸出后，將板中殘留洗滌液扣拍到吸水材料上;(9)每孔加入100μL辣根過氧化物酶標(biāo)識PＲVgE抗體;(10)室溫下孵育20min;(11)重復(fù)(8);(12)每孔加入100μLTMB底物液，室溫下孵育15min;(13)每孔加入50μL終止液，便反應(yīng)終止;(14)自動酶標(biāo)讀數(shù)儀上測量并記錄被檢樣品和對照的A650計算:

     陰性對照平均值:NcX=［Al+A2+A3］/3;

     

     陽性對照平均值:PcX=［A4+A5］/2;

     樣品與陰性對照的比率:S/N=樣品A650/NcX

     陰性對照A650平均值減去陽性對照A650平均值必須大于或等于0.3，試驗(yàn)方有效，否則應(yīng)重做。如S/N值低于或等于0.60，則為PＲVgE抗體陽性;如S/N值在0.60(大于)－0.70(小于或等于)之間樣品應(yīng)重測(可疑);如S/N值大于0.70，則為PＲVgE抗體陰性。

     利用這種檢測方法，我們可以把不同的省份、地區(qū)，不同的豬場、豬群的偽狂犬病野毒感染狀況做一對比，綜合評定該地區(qū)、豬場偽狂犬病感染的壓力大小。進(jìn)而采用不同的控制、免疫方案和措施。

     根據(jù)種豬群偽狂犬病gE抗體的測定情況，調(diào)查和分析種公豬群、種母豬群之間偽狂犬病野毒感染率之間的關(guān)系，評價和確定公豬在偽狂犬病野毒感染和傳播中的作用;觀察種母豬群之間隨著胎次的不同，其感染特點(diǎn)有沒有內(nèi)在的聯(lián)系。根據(jù)豬場種豬群不同的感染現(xiàn)狀和免疫方法，調(diào)查和分析種豬群與商品豬群之間偽狂犬病野毒感染率有沒有內(nèi)在的關(guān)系，為不同豬群采用不同的控制凈化方案提供實(shí)踐依據(jù)。

     我國不同豬場種豬群偽狂犬病gE抗體檢測結(jié)果見表1。

   

     由表1可以看出，在檢測的672份種豬群血清中，有394份是偽狂犬病野毒陽性。不同的豬場、不同的種豬群(公豬、母豬及其不同胎次)野毒感染比例差異顯著。種母豬群與種公豬群的感染比例有著正相關(guān)的關(guān)系，種母豬群之間隨著胎次的增加偽狂犬病野毒感染比例也在逐漸增加。

    

     由表2可以看出，第1組17個場870份樣品，其中有286份陽性，陽性率33%。其中種豬群的陽性率56%，商品豬群的陽性率5.8%，陽性豬數(shù)量中種豬群比例遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于商品豬群。第2組5個場192份樣品，其中有51份陽性，陽性率26.6%。其中種豬群的陽性率17.6%，商品豬群的陽性率48.2%，陽性豬數(shù)量中商品豬群比例遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于種豬群。由此可以看出，商品豬的偽狂犬病野毒感染率與種豬群的偽狂犬野毒感染率沒有明顯相關(guān)性。

     種豬群試驗(yàn)結(jié)果表明，種母豬群的偽狂犬病野毒感染率與公豬群的野毒感染率呈明顯的正相關(guān)關(guān)系。母豬群的偽狂犬病野毒感染率隨著母豬胎次的增加感染比例也逐漸增加。從生產(chǎn)實(shí)際來看，種豬群每年3次的免疫程序(偽狂犬gE基因缺失弱毒疫苗，進(jìn)口疫苗居多)其水平傳播的可能性很小。那么種母豬群的偽狂犬病野毒傳播的主要來源應(yīng)該是與配種的次數(shù)相關(guān)，與配種次數(shù)相關(guān)的感染來源無疑要考慮的就是公豬帶毒并通過配種傳播。這樣看來，母豬群的偽狂犬病野毒感染與公豬密切相關(guān)。因此，在種豬群的偽狂犬病野毒感染控制中，公豬應(yīng)是重中之重。

     分組試驗(yàn)結(jié)果表明，種豬群與商品豬群偽狂犬感染不存在必然的聯(lián)系，種豬群偽狂犬病野毒感染比例很高，但實(shí)行了偽狂犬gE基因缺失弱毒疫苗滴鼻免疫的商品豬群偽狂犬病野毒感染比例很低;而在另一些豬場，種豬群偽狂犬病野毒感染比例很低，但沒有實(shí)行滴鼻免疫的商品豬群，特別是中、大豬偽狂犬病野毒感染比例很高。因此，在養(yǎng)豬生產(chǎn)實(shí)際過程中，規(guī)?；i場在生物安全、硬件設(shè)施、管理水平等生產(chǎn)狀況大致相同的條件下，種豬群、商品豬群偽狂犬病野毒感染之間沒有必然的聯(lián)系，可能是免疫控制方案(程序、方式、方法等)的差異而形成的不同的結(jié)果。經(jīng)現(xiàn)場調(diào)查，也證實(shí)了這一分析結(jié)果，即仔豬的早期滴鼻免疫對控制商品豬群偽狂犬感染具有顯著的積極作用。

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué)牧醫(yī)工程學(xué)院，焦顯芹;河南長葛市石固鎮(zhèn)政府，杜紅喜;北京世紀(jì)元亨動物防疫技術(shù)有限公司，賀紀(jì)云)